ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследований.
Развитие научно-технического прогресса в течение 20 века принесло человечеству кроме новых возможностей и дополнительных благ, проблему загрязнения окружающей среды. На протяжении веков отходы деятельности человека утилизировались с помощью естественных природных процессов. Но эта стабильность была нарушена по ряду причин. Демографический взрыв и возрастание расходов энергии и сырья привели к бесконтрольному поступлению в окружающую среду всё больших объёмов антропогенных загрязняющих веществ. Каждый год регистрируется до полумиллиона новых химических соединений, многие из которых не поддаются биодеградации. В этот объём входят около 1500 пестицидов, 4000 лекарственных препаратов, 38000 потенциально токсичных веществ и 50000 промышленных химикатов (Бочков, Чеботарев, 1989). Такое количество соединений создает множество проблем, в том числе необходимость прогнозирования последствий их широкого применения. Следует отметить, что в окружающей среде многие соединения могут длительно циркулировать в биосфере и, включаясь в пищевые цепи, накапливаться в различных компонентах экосистем.
В настоящее время токсикологические характеристики становятся неотъемлемой частью описания многих водоемов. Антропогенное загрязнение оказывает растущее негативное воздействие на биологические ресурсы водоемов и является одним из главных факторов нанесения ущерба рыбному хозяйству. Для сохранения водных биоресурсов, как основы благополучия промысловых запасов, необходим постоянный мониторинг состояния водных экосистем (Воловик, 2000; 2002).
Для Азовского моря, биоресурсы которого существенно сократились, проблема накопления токсикантов, в частности, веществ, вызывающих повреждение наследственного аппарата гидробионтов, особенно актуальна. Бассейны двух больших рек - Кубани и Дона, впадающих в море,
6
расположены в районах с интенсивно развитыми сельским хозяйством, химической, горнодобывающей промышленностью и машиностроением. Спектр попадающих в море токсикантов необычайно широк, что, безусловно, затрудняет применение для мониторинга загрязнения методов химического анализа. Поэтому использование методов интегральной оценки токсикологических характеристик компонентов экосистем является важнейшей частью экологических исследований биологических ресурсов. Особого внимания заслуживает способность многих соединений повреждать наследственный аппарат живых организмов. Известно, что действие мутагенов - веществ, вызывающих мутации или иные генетические повреждения, приводит к росту числа наследственных заболеваний, врожденных уродств и развитию злокачественных опухолей (Арефьев, 1998).
Особая опасность мутагенных соединений заключается в том, что они могут вызывать значительное увеличение числа рецессивных мутаций, ведущих к тяжелым заболеваниям, которые не проявляются в первом поколении, но, постепенно накапливаясь, могут через несколько поколений вызвать "взрыв" заболеваемости у различных живых объектов.
В оценке опасности и направленности происходящих изменений качества водной среды значительную информативную ценность представляет биотестирование генетической опасности различных компонентов экосистемы при помощи экспресс-тестов на микроорганизмах, дрозофиле, растениях. Первоначально применяли тест-системы для определения частоты мутаций, поэтому использовали термин "мутагенность". Однако мутации - далеко не единственный феномен, вызываемый повреждением генетического аппарата и поскольку применение тестов, основанных на других генетических эффектах, зачастую оказывается более информативным, в настоящее время чаще применяют близкий, но не идентичный, термин "генотоксичность" (Muller et al., 1999).
Анализ литературы, а также данных, полученных нами в 1989-2000 годах по Азово-Донскому бассейну, показал, что загрязнение гидросферы
7 генотоксикантами носит масштабный характер. Практически все компоненты
водных экосистем Азовского моря в большей или меньшей степени подвержены действию ксенобиотиков, вызывающих повреждение наследственного аппарата гидробионтов, что негативно сказывается на состоянии биоресурсов бассейна (Воловик, 2000; 2002). Причем уровни загрязнения настолько высоки, что эффекты регистрируются без концентрирования образцов.
Однако из-за недостаточно высокой производительности методов, использованных при исследовании Азово-Донского бассейна (Тихонова, Чистяков, 1996; Корниенко и др., 1998; Дехта и др., 2000), данные по корреляции генотоксичности с результатами химического анализа поллютантов, а также по воздействию генотоксикантов, накопившихся в тканях рыб, на их физиолого-биохимическое состояние, в достаточной степени фрагментарны.
В последние годы особое внимание уделяется люминесцентным биосенсорам, которые реагируют на специфические молекулярные изменения в клетке. Перспективность и преимущества использования методов, основанных на применении биосенсоров, очевидны. Они исключительно чувствительны, объективны и на их количественное выражение не влияет эндогенная активность клеток — хозяев. В настоящее время разработан ряд биолюминесцентных тестов на генотоксичность, в том числе на SOS-индукцию. Эти тесты способны регистрировать генетическую активность широкого спектра химически чистых соединений, однако их применение для природных объектов, в которых эти вещества содержатся в виде сложных комплексов, ограничено опасностью возникновения ряда артефактов (Ржевский и др., 1998).
При анализе исследований по генотоксичности тканей обитателей Азово-Донского бассейна, не менее интересным является вопрос о механизмах адаптации гидробионтов к выявляемому загрязнению. Определение уровня антимутагенной защиты может стать важным показателем для оценки
8
адаптивного потенциала популяций гидробионтов из экологически неблагополучных водоемов. Для изучения этого вопроса необходим специальный тест на антимутагенную активность экстрактов тканей гидробионтов.
Поэтому целью данной работы было: 1) разработать метод адекватной оценки генетической активности и исследовать генотоксичность компонентов водной экосистемы Азово-Донского бассейна, определяющих ее биоресурсный потенциал; 2) выявить связь с результатами биохимических исследований тканей биообъектов; 3) оценить антимутагенную активность тканей гидробионтов Азово-Донского бассейна, как показатель, определяющий устойчивость биоресурсов к загрязнению генотоксинами; 4) оценить перспективы использования показателей генотоксичности для оценки биоресурсного потенциала.
Основные задачи исследований.
Одной из главных экспериментальных задач была разработка теста для мониторинга генотоксических факторов компонентов водных экосистем, защищенного от наиболее вероятных артефактов, и теста для оценки антимутагенной активности тканей гидробионтов. Для ее осуществления необходимо было провести ряд методических разработок:
- получить рекомбинантные штаммы Е. coli для SOS-lux теста;
- разработать вариант метаболической активации, оптимальный для SOS-lux теста;
- разработать оптимальный метод экстракции для извлечения генотоксинов из донных отложений и тканей гидробионтов;
К задачам мониторинга состояния биологических ресурсов относятся следующие:
- оценить генотоксичность воды и донных отложений водных объектов некоторых районов Азово-Донского бассейна при помощи SOS-lux теста, найти связь генотоксичности и данных химического анализа поллютантов в них;
9
- оценить генотоксичность тканей гидробионтов Азово-Донского бассейна в SOS-lux тесте; найти возможную корреляцию с характеристиками функционального состояния гидробионтов.
- оценить антимутагенную способность тканей гидробионтов водоемов Азово-Донского бассейна, составляющих их биоресурсный потенциал;
- оценить возможность использования данных по генотоксичности для прогноза биопродуктивности водоемов Азово-Донского бассейна в условиях антропогенной нагрузки.
Научная новизна.
Впервые предложена более корректная модификация SOS-lux теста, позволяющая избежать ряда артефактов, связанных с влиянием тестируемых соединений на активность люциферазы, что особенно важно при работе с тканями гидробионтов.
Подобраны оптимальные условия метаболической активации для выявления промутагенов. Выявлены эффективные методы пробоподготовки воды, донных отложений и тканей гидробионтов.
Новизной отличаются исследования генотоксичности экстрактов донных отложений Нижнего Дона от места впадения р. Дон в Таганрогский залив (створ, 0 км), до устья р. Северский Донец в разные сезоны 2001 и 2002 гг. Выявлены места стабильного загрязнения генотоксинами, что позволяет прогнозировать в этих районах деградацию биоресурсов.
Новыми являются данные о повышенной загрязненности генотоксинами донных отложений Азовского моря по сравнению с р. Дон, проведен анализ корреляции обнаруженных генотоксических эффектов с результатами химического мониторинга. На основании полученных данных проведено картирование генотоксичности донных отложений Нижнего Дона и Азовского моря.
Впервые проведен анализ корреляции генотоксичности тканей и биохимических характеристик функционального состояния осетровых рыб.
10
Впервые исследован антимутагенный потенциал тканей рыб Азово-Донского бассейна (русский осетр, севрюга, пиленгас, чехонь, тарань), как показатель, позволяющий оценить сравнительную устойчивость биоресурсов к генотоксическому прессингу.
Теоретическая и практическая значимость работы и реализация результатов исследований.
Разработан вариант биолюминесцентного теста на SOS-индукцию, позволяющий корректировать артефакты, связанные с подавлением активности люциферазы, что дает возможность оперативно оценивать генотоксичность основных компонентов, определяющих биоресурсный потенциал водных экосистем. Полученные результаты могут служить сигналом существования негативных тенденций в развитии биоресурсного потенциала водных экосистем.
На репрезентативном материале изучены статистические взаимосвязи между биохимическими и генетико-токсикологическими характеристиками ценнейшего вида биоресурсов Азовского моря - осетровых рыб. Показано, что негативные последствия индукции микросомальных оксигеназ не исчерпываются истощением токоферола. Взаимодействие промутагенов с этими ферментами ведет не только к детоксикации, а часто к превращению в генотоксиканты прямого действия, способные вызывать повреждение клеточной ДНК.
Показано, что ткани осетровых рыб (Acipenseridae) Азовского моря обладают более высокими, по сравнению с костистыми (Teleostei), уровнями низкомолекулярных антимутагенов, что может являться одним из механизмов, обеспечивающих высокую адаптационную способность хрящевых ганоидов, в том числе и к загрязнению водной среды.
Выявлены районы нижнего Дона, для которых характерно хроническое загрязнение генотоксинами, показана тенденция к аккумуляции этого класса токсикантов в Азовском море.
11
Выявление элементов-доминантов загрязнения природной среды позволит проводить направленный поиск источников загрязнения -предприятий, технологических звеньев и пр., которые несут ответственность за формирование высокой техногенной нагрузки в экосистемах.
Разработанный метод оценки антимутагенного эффекта позволяет определять антимутагенный потенциал гидробионтов, опосредованный содержанием в их тканях антиоксидантов, что позволяет оценивать адаптационный потенциал разных видов биоресурсов, в том числе и устойчивость к загрязнению генотоксическими веществами.
Возможно применение метода как для массового мониторинга антимутагенного потенциала гидробионтов, который может стать важным показателем для оценки адаптивных возможностей популяций обитателей загрязненных водоемов и сохранения биологических ресурсов, так и для поиска новых природных антимутагенов. Выявление антимутагенов имеет также практическое значение, поскольку они являются основой большого числа лекарственных препаратов и пищевых добавок.
На основании данных, полученных в результате проведенных исследований, можно полагать, что осетровые рыбы могут служить не только пищевым объектом, но и возможным источником веществ, защищающих генетический аппарат человека от деструктивных воздействий экзо - и эндогенных факторов.
Разработанный для целей данного исследования тест используется для мониторинга среды обитания и оценки биоресурсного потенциала промысловых рыб Азово-Донского бассейна, а также для оценки отдаленных последствий влияния загрязнения среды на биологические ресурсы при проведении нефтеразведки и нефтедобычи на Северном Каспии.
Апробация работы.
Результаты диссертации доложены на 2 съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров (Санкт - Петербург, 2000); на научно-практической конференции «Проблемы и перспективы развития аквакультуры
12
в России» (Краснодар, 20 01); на Международной конференции «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах» (Москва, 2002) и Ученых Советах Азовского НИИ рыбного хозяйства.
Публикация результатов исследований.
По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе получен патент РФ №2179581.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 161 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 таблицами, 9 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 90 источников отечественных и 128 зарубежных авторов.
Личный вклад автора.
Автором самостоятельно выполнена экспериментальная часть работы, статистически обработаны и обсуждены все результаты, имеются самостоятельные публикации.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Генотоксичность основных компонентов водных экосистем, определяющих их биоресурсный потенциал, может быть адекватно оценена с помощью разработанного варианта SOS-lux теста в комплексе с соответствующими методами пробоподготовки.
2. Загрязнение водоемов Азово-Донского бассейна генотоксичными веществами вызывает у ряда ценных промысловых рыб функциональные изменения, ведущие к деградации соответствующих видов биологических ресурсов.
3. Антимутагенный потенциал позволяет сравнить устойчивость разных видов биоресурсов к загрязнению генотоксинами.
Работа проводилась в лаборатории комплексной экологической экспертизы АзНИИРХа в соответствии с планом научно-исследовательских работ согласно научно-технической отраслевой программе Государственного
13 Комитета РФ по рыболовству «Провести комплексные исследования
биоресурсов Азово-Черноморского бассейна с целью их рациональной эксплуатации, сохранения и разработки долгосрочных перспектив развития рыболовства» (проект «Биоресурсы»).
14 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика биотических и абиотических компонентов экосистем рыбохозяйственных водоемов Азово-Донского бассейна
Общая характеристика биоты. Азовское море — водоем с уникально высокой биологической продуктивностью и своеобразной структурой биологической составляющей водоема.
Фитопланктон Азовского моря сформировался под воздействием нестабильной солености, поэтому его видовое богатство и количественные показатели нестабильны.
В Азовском море и Таганрогском заливе обитает 605 видов, разновидностей и форм истинно и факультативно планктонных водорослей (Пицык, 1963; Прошкина-Лавренко, 1963; Студеникина и др., 1999). Наиболее широко в таксономическом плане представлены пиррофитовые, зеленые, диатомовые и сине-зеленые водоросли. Основную роль в формировании общей биомассы фитоценоза играют диатомовые и пиррофитовые водоросли. Эвгленовые, золотистые и желто-зеленые составляют около 5% общего числа видов (Студеникина и др., 1999).
Сообщество зоопланктона Азовского шельфа представлено веслоногими и ветвистоусыми ракообразными, инфузориями, коловратками и другими организмами. Для бассейна также характерны представители меропланктона, в частности, личинки полихет, моллюсков, мшанок, усоногих и десятиногих ракообразных. Важную роль в сообществе донных беспозвоночных играют полихеты. Они имеют существенное рыбохозяйственное значение, составляя значительную долю пищевого рациона ценных промысловых рыб (Фроленко, 2000).
По данным Л.А.Зенкевича (1963), макрозообентос Азовского моря насчитывает 186 видов. По численности в биоценозах преобладают ракообразные (средняя численность до 11345 экз./м3), однако по биомассе
15
доминируют двустворчатые моллюски, средняя биомасса которых достигает 98 г/м3 (Зенкевич, 1963).
Двустворчатые моллюски составляют основу донных биоценозов Азовского моря и Таганрогского залива. Среди массовых видов отмечены Cardium edule, Chione Gallinae, Anadonta sp. Отмечено два вида брюхоногих моллюсков. Класс Crustacea был представлен мраморным крабом, усоногими раками и несколькими пресноводными формами. Из типа Annelida отмечены черви из кл. Oligochaeta и Polychaeta.
Изменчивость солености Азовского моря вызывает глубокие изменения видовой структуры планктонных и донных биоценозов. В их числе -проникновение в водоем различных черноморских мигрантов -микроводорослей, зоопланктеров, бентосных животных и рыб. Обязательным компонентом планктона стали медузы корнерот и аурелия, а в настоящее время по акватории Азовского моря широко распространился гребневик, который подорвал кормовую базу рыб и особенно массовых морских хамсы и тюльки (Макаров и др., 1999).
Ихтиофауна Азовского моря включает 103 вида и подвида рыб, относящихся к 76 родам и 36 семействам. Из них редкими являются 14 видов, исчезающими и уязвимыми - 7. Чисто морских видов отмечено 39, пресноводных - 8, анадромных и катодромных мигрантов - 14, обитателей солоноватоводных районов - 42. Среди них особое промысловое значение имеют судак, лещ, рыбец, тарань, тюлька, севрюга, пиленгас и др. Фауна Таганрогского залива вдвое беднее собственно Азовского моря и включает 55 видов, относящихся к 36 родам и 16 семействам. Она состоит преимущественно из пресноводных, солоноватоводных форм и мигрантов, среди которых к редким относятся 3, к исчезающим и уязвимым - 6 (Воловик, Чихачев, 1998).
Ихтиофауна Нижнего Дона, Кубанских лиманов и других водоемов региона представлена 134 видами и подвидами, относящимся к 90 родам, 42 семействам. В бассейне реки Дон отмечено 75 видов, в дельте Дона - 61, в
16
нижнем течении Дона - 65, в реке Маныч, Веселовском и Пролетарском водохранилище - 41 вид. Отмечается обогащение состава ихтиофауны за счет внедрения акклиматизантов - растительноядных рыб и пиленгаса. Наиболее богата - 68 видов - ихтиофауна лиманной системы дельты Кубани. В последние годы вновь создались условия для обитания бычков, уклеи, густеры, плотвы, иглы-рыбы. Велика численность сазана, толстолобиков, леща, чехони, жереха, серебряного карася (Воловик, Чихачев, 1998).
В ЗО-е годы текущего столетия Азовское море являлось одним из важнейших рыбопромысловых районов бывшего СССР. Здесь добывалось более 300 тыс. т. различных промысловых рыб, в том числе до 164 тыс.т отлавливалось осетровых, судака, леща, тарани и других проходных и полупроходных рыб.
Важную роль в формировании запасов рыб играет экосистема Таганрогского залива. Здесь происходит нагул молоди и взрослых рыб, нерест морских рыб, проходят основные миграционные пути ценных промысловых видов. Одной из особенностей современной местной фауны рыб является наличие самовоспроизводящихся стад и популяций интродуцированных и акклиматизированных видов. Пожалуй, ни в каком другом водоеме нельзя отметить таких масштабов искусственного воспроизводства, как в Азовском море. Популяции осетра и севрюги состоят на 81-90% из рыб, воспроизведенных на рыбоводных заводах (Дехта, Сергеева, 1997; Макаров, Реков, 1997; Чебанов, Карнаухов, 2001; Chebanov, Billard, 2001).
За последние годы экосистема Азовского моря испытала значительную антропогенную нагрузку. В результате резко снизилась продуктивность водоема, и рыбопродуктивность, в частности. Рыбные богатства Азовского моря и Приазовья испытали падение запасов и промыслового значения. Цепь неблагоприятных изменений в абиотической части экосистемы Азовского моря и экологических преобразований привели к падению его биологической продуктивности почти вдвое, кормовая база различных рыб уменьшилась в 2-4 раза, промысел ценных видов рыб пресноводного комплекса снизился в 15-30
17 раз. Если в 80-х годах ежегодные уловы осетровых поддерживались на уровне
1000-1400 тонн, то в 1999 году они упали до 217 тонн (Макаров и др., 2000).
С конца семидесятых годов и фактически до настоящего времени уловы в Азовском море резко упали до 50-100 тыс. т в год. Добыча проходных и полупроходных рыб не превышала 5-7 тыс. т в год. Резко уменьшилось разнообразие ихтиофауны (Воловик, 2000). В последние годы постоянными обитателями остались только 29 видов рыб (Воловик, Чихачев, 1998).
В настоящее время одним из основных объектов промысла в Азовском бассейне является дальневосточная кефаль - пиленгас, которая была акклиматизирована в 1976-1988 гг. Ее запасы позволяют сейчас вылавливать более 8 тыс. т (Воловик, 2002).
Естественно, что современные экономические проблемы негативно отражаются на уровне пополнения рыбных запасов. Однако, несмотря на имеющее место в последние годы значительное падение уловов промысловых рыб, значение Азовского бассейна, как резервуара уникальных генетических ресурсов гидробионтов, не вызывает сомнений. На состояние и численность рыбного населения оказывают влияние химические поллютанты, которые попадают в водоемы с сельскохозяйственных полей, с бытовыми и промышленными стоками городов. В условиях токсикологической нагрузки репродуктивная способность рыбы снижается, что является одной из важных причин снижения численности и уменьшения общей биомассы рыб Азовского моря и Приазовья. Загрязнение ксенобиотиками гидробионтов способствует истощению генетических ресурсов не только за счет уменьшения численности видов, но и за счет деградации их генофондов, вызванной накоплением изменений генетических показателей.
Основные характеристики гидрологического режима. Азовское море сформировалось в районе со сложным геологическим прошлым. Фазы опреснений и осолонений чередовались, причем амплитуда колебаний солености была значительной и охватывала весь диапазон минерализации воды от пресного до океанических уровней. Небольшие размеры моря, малые